2013届本科生毕业设计(综述

 

 

题目:蛋白质化学修饰的新热潮

 

所  在  系

药 学 系

所 学 专

药  学

年级、班

2009级药学2

学      号

200908070039

完成人姓

李锐

指导教师姓

王红

 

20130315 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

题目:蛋白质化学修饰的新热潮

 

 

 

 

 

 

 

完成人姓

李锐

                      

 

 

 

 

20130315 

 

 


皖南医学院本科毕业设计(论文)-综述                               蛋白质化学修饰的新热潮

 

 

目  录

 

 

 

中文摘要-------------------------------------------------------------2

英文摘要-------------------------------------------------------------2

关键词--------------------------------------------------------------2

正文----------------------------------------------------------------2

1 化学修饰的原理-----------------------------------------------------2

1.1蛋白质分子侧链基团的改变------------------------------------------2

1.2蛋白质分子主链结构的改变------------------------------------------3

2 PEG修饰-----------------------------------------------------------3

2.1原理与方法------------------------------------------------------3

2.2修饰反应条件的进行----------------------------------------------3

2.3 PEG化对蛋白质生物活性的影响---------------------------------------3

2.4 PEG化蛋白质类药物的应用-----------------------------------------4

3其他蛋白质修饰方法--------------------------------------------------4                                                                       4现状与展望--------------------------------------------------5

参考文献------------------------------------------------------------5

 

 

 

 


 

蛋白质化学修饰的新热潮

 

摘要蛋白质分子具有极其复杂的结构层次,用化学修饰的方法研究蛋白质分子的结构与功能关系一直是生物化学和分子生物学领域的热点。在已有的研究基础上,综述蛋白质修饰的原理、主要类型及应用前景。其中,PEG运用于生物领域已成为蛋白质化学修饰研究的热点。

关键词蛋白质,化学修饰,PEG,偶联

 

NEW TRENDS IN CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEIN

Abstract:              Employing chemical modification to study the relations between proteins structure,which is very complex,and function has been a fouse in biochemistry and molecular biobogy research. Summary protein modification in the existing research on the basis of the principle of the main types and application prospects.Among them, PEG used in the biological field has become a protein chemical modification research hotspot.

Key Wordsprotion Chemically modifiedPEGCoupling

 

生命有机体是一个复杂、动态的系统,时刻不断进行着新陈代谢。其中蛋白质是机体内各种功能的执行者,蛋白质功能正常的发挥决定着有机体能否有序、高效的进行。有些疾病的产生,是由于蛋白质的结构发生改变,故对蛋白质进行化学修饰成为治疗某些疾病的有效措施。蛋白质化学修饰的主要类型有糖基化、乙酰化、泛素化、磷酸化以及近年发现的SUMO化,是自20世纪70年代末以来,有关用合成高分子聚乙二醇(PEG)及其衍生物进行蛋白质化学修饰的研究报道越来越多1其中Enzon公司研制的PEG-门冬酰胺酶,PEG-腺苷脱氨酶和PEG-干扰素以相继面世。

1            化学修饰原理

蛋白质化学修饰主要包括蛋白质分子的侧链基团的改变和蛋白质分子主链结构改变两个方面,其中前者研究较多。

1.1蛋白质分子侧链基团的改变

蛋白质侧链基团的化学修饰是一种广泛使用的研究手段,也是一种比较成熟的经典技术。在蛋白质特别是酶的机构与功能研究中,从起过十分重要的作用,如血红素-蛋白微缩模型的制备,以期望弄清楚蛋白链是怎样调节血红素的性质而产生如此多的活性。Sakamoto[2]研究了许多四螺旋束蛋白质,它们在电解质溶液中自动折叠以形成血红素结合点,以容纳一个组氨酸二配位的血红素,这对于搞清楚血红蛋白的作用机理以及结构与功能之间的关系很有帮助,蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的,包括巯基修饰、氨基修饰、羧基修饰等。

1.2蛋白质分子主链结构的改变

蛋白质主链化学修饰研究的原理,即利用蛋白质分子主链的切断和连接,使蛋白质分子的化学结构及其空间结构发生某些改变,从而改变蛋白质的特性和功能的方法。研究最多的蛋白质之一就是胰岛素,胰岛素是由AB两条肽链组成,肽链之间靠两对二硫键(A7-B7A20-B19)相连接,科学家利用两条链的不同特性,将两条链进行化学修饰,从而获得医药上有用的胰岛素衍生物,包括长效胰岛素、速效胰岛素、口服胰岛素,这些胰岛素具有良好的应用前景和潜正在的巨大价值,如杨士珍等3合成了[A8HiA8His,A9Arg,A10Pro,A21Ala]胰岛素类似物,并通过与她们的受体结合、小白鼠惊厥反应和抗体结合试验,试图说明A8-10区域对胰岛素受体结合及免疫原性的影响。

2            PEG修饰

PEG的分子量范围很宽,适合用作修饰剂或修饰剂出发原料,PEG的相对分子量一般为50020000PEG既溶于水,又溶于绝大多数溶剂,但不溶于乙醚、脂肪烃。PEG通常没有免疫原性和毒性,又不会破坏生物分子的活性 ,其生物相容性已通过美国食品和药品管理局(FDA)认证4经过几十年的发展,PEG化技术不仅在蛋白质类的药物开发中得到普遍应用,而且已扩散到新型药物载体、控释制剂等各个领域5

2.1               原理与方法

PEG为一种亲水、不带电荷的线性大分子,当它与蛋白质的非必须基团共价结合时,可作为一种屏蔽挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇,避免抗体的产生,蛋白质经PEG修饰后,分子量增加,肾小球滤过率(GFR)减小;PEG的屏蔽作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解,同时减少了抗体的产生,这些均有助于蛋白质药物循环半衰期的延长。目前,PEG修饰普遍采用的是单甲氧基聚乙二醇(mPEG):CH3O-(CH2-CH2O)n-HPEG末端的羟基是化学反应的功能基团,但必须在较激烈的条件下才与其它基团发生反应,为使蛋白质能在温和条件下,以较高的速率与PEG偶联,须先对PEG进行活化,活化的PEG可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反应而与蛋白质相偶联,蛋白质分子上与PEG进行偶联的基团主要是氢基、巯基和羧基6

2.2               修饰反应条件的进行

蛋白质的修饰可以在固相和液相中进行,反应过程中,反应的温度、pH、反应介质和反应物配比等都要控制在一定的范围,必须满足的是:一是不引起蛋白质的不可逆变性,二是有利于选择性地修饰蛋白质。在所有影响蛋白质分子的化学修饰反应的条件中,pH是最重要的一个条件,一般情况下,增加pH可以提高反应速率,降低pH反应速率减小7温度也是一个必须要注意的条件,因为温度可以影响到活性巯基的微环境,恰当的温度可以减少或防止一些竞争基团的反应。反应介质可改变蛋白质的构象或封闭反应部位,从而影响修饰反应。

2.3               PEG化对蛋白质生物活性的影响

一般认为,经PEG修饰后,大多数蛋白质会发生以下变化:免疫原性与抗原性降低;②循环半衰期延长;溶解性增加;耐蛋白酶水解;生物利用度提高;毒性减小;热稳定性及机械稳定性增加;等电点、电泳行为、动力学性质等改变8。另外,蛋白质经PEG修饰后会引起生物学活性降低,对某一确定的活化PEG修饰过程,蛋白质活性降低程度主要取决于PEG化程度、PEG化位点及修饰对蛋白质构象和电荷的影响。

2.4               PEG化蛋白质类药物的应用

1990PEG化的S-腺苷脱氨酶获FDA批准上市,使PEG化技术开始真正走向市场,到2013年共有9PEG化生物技术药物获得FDA批准上市9(见下表)还有几十种药物处于临床或临床前研究阶段。

国外上市的PEG-蛋白药物

产品

临床应用

上市时间

腺苷脱氨酶

天冬酰胺酶

干扰素a2b

干扰素a2b+利巴韦林

干扰素a2a

干扰素a2a+利巴韦林

粒细胞集落刺激因子

生长抑素

PEG-睡凝胶

免疫缺陷性疾病

白血病、黑色素瘤

慢性丙型肝炎

丙型肝炎

 

代偿性肝病、慢性丙型肝炎

代偿性肝病、慢性丙型肝炎

 

粒细胞减少症

 

肢端肥大症

防止术后粘连

1990

1994

2000

2001

 

2004

2004

 

2007

 

2009

2012

  1.   其他蛋白质修饰方法

     其它饰方法包括糖苷化、乙酰化、泛素化、磷酸化以及近年来发现的SUMO化。

在所有的蛋白质中,将近50%的蛋白被核苷化或结合多种核苷,在多种多样的生物过程中,从胚胎发育,组织分裂,到蛋白质结构  糖苷化都发挥作用,蛋白糖苷化的两个主要类型是N-糖苷化和O-糖苷化[10],O-糖苷化多发生在临近脯氨酸或苏氨酸残基上,糖苷化点处的蛋白多为b构型。N-糖苷化是在内质网上由糖基转移酶催化后,在内分泌蛋白和膜合蛋白的天冬氨酸残基的氨基上结合寡糖的过程,大多研究表明,糖苷化在免疫保护,病毒复制,组织生长,细胞与细胞粘附,炎症的产生等过程和发挥重要的作用。

   乙酰化修饰过程主要发生在组蛋白上,是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)催化的,其反应过程去乙酰化由组蛋白去乙酰酶(HDS)催化的,乙酰化使组蛋白与DNA间的作用减弱,导致染色体构象松散,这种构象有利于转录调节基因的接近,从而可以和转录基因结合,促进基因转录11

     蛋白质泛素化,或靶蛋白共价结合泛素,在蛋白质降解中的研究最深入。泛素介导的信号转导的多样性是取决于目标蛋白可以通过多种方式被泛素修饰,在一个或者多个位点的单泛素化和通过几种可能键合的多泛素化12每一个泛素分子有几个可能的赖氨酸残基可用于泛素链的延伸,因此,多泛素化的功能取决于泛素链延伸中所用的氨基酸残基。而这时由于特异的E221(泛素结合酶)E31(泛素连接酶)确定的,但E1(泛素结合酶)没有特异性。泛素化对细胞的分化,细胞器的生物合成,细胞凋亡,DNA修复,新蛋白合成,免疫应答和应激等生理过程起着重要作用,Engelender13发现,Lewy体中存在泛素连接酶E3SIAM-1SIAM-2SYNPHILIN-1的相互作用,

   在有机体内,磷酸化是蛋白质修饰最为广泛的共价修饰形式,该过程主要是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的末端磷酸基团转移到蛋白的特定位点上,如SerThrTyr残基上,而且逆向过程则由蛋白质磷酸化去除相右的末段磷酸基团。磷酸化与癌症的发生有着微妙的关系14,在癌症的研究过程中发现,将含有硝基化的络氨酸的a-微管蛋白组装到微管上,将导致微管功能失常而最终导致细胞凋亡。但如果微管蛋白络氨酸连接酶(TTL)被磷酸化后,将可能使细胞躲过”LPC控制的细胞凋亡,从而最终发展成癌细胞。

   小泛素相关修饰的(SUMO)分子是一种近年发现的泛素样分子,也参与蛋白质翻译后修饰,但是不介导靶蛋白酶降解,而是可逆性修饰靶蛋白,参与靶蛋白的定位及功能调节过程13。大量研究表明,SUMO化修饰通过DYNAMIN相关蛋白即参与线粒体分裂,参与DNA损伤及修复,基因稳定调节。参与K2P离子通道的调控。同时SUMO还是生物体调节的重要分子14

  1. 现状与展望

  化学修饰是一种重要的设计蛋白质手段,同时在生命有机体的正常有序运行中发挥着关键的调节作用。当前PEG化技术在蛋白质类药物(或其他药物)的开发中已经越来越受人们重视,进入21世纪以来,随着生命科学技术的飞速发展,计算机图像模拟应用、化学合成技术的改进,为蛋白质修饰技术提供了有利条件,同时也为改进修饰也有药用蛋白,获得更多的药效更高,选择性更好的新蛋白提供了一个新途径。

糖蛋白化学修饰的发展发向:(1)种类更多,选择性更好,活性更高的修饰剂的制备,以使修饰剂综合性更为理想;(2)适宜的修饰条件的探索,以达到修饰可控,修饰物均一;(3)简便,准确,灵敏,快速分析方法的建立,以实现对修饰过程和准确,有效监控。

 

 

 

 

 

 

参考文献

1   Inada Yuji,Furukawa Makoto,Sasaki Hideyuji,et al.Biomedical and biotechnological applications of PEG and PM-modified proteinJ.Tibtech,1995,13:86-91

2   SAKAMOTO S,OBATAYA I,MIHARA H,Effects on aminoacids substitution of hydrophobic residues on haem-binding properties of designed two-a-helix peptides J.J chem. Socperkin trans,1999,2;2059-2069

3   杨世珍,林 威,陆经义等.A21-Ala及相关的螺旋区缺失的胰岛素类似物的合成与生物活性[J.生物化学与生物物理学报,1992,246):503-506

4   Venonese F M,Morpurgo M.Bioconjugation in Pharmaceutical ChemistryJ.Inter J Pharmaco,1999,54:497-516

5   Habeeb AFSA.Reaction of protion groups with Ellman,s Reagent.Methods J.Enzymol,1972,25:457-464

6   Venonese F M,Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions J.Biomaterials,2001,22:405-417

7   Farnuggia B,Nuci H D,et al.Thermal Features of the Bovine Serum Albumin Unfolding by Polyethylene GlycolsJ.Inter J Biological Macromol,1999,26:23-33

8   姜中义,徐松伟,高昊.生物分子化学修饰用聚乙二醇衍生物的合成及应用[J.高分子通报2002,(1):34-40

9   周海梦,王洪瑞主编.蛋白质化学修饰(M.北京:清华大学出版社,1998,4-30

10      BlomN,Sicheritz-Ponten T,Gupta R, etal.Prediction of post-translational glycosylation and phosphorylation of proteins form the amino acid sequence,Protemics, 2004(4):722-727

11      Gray MW,Burger G,Lang BF. Mitochondrial evolution. Science, 1999,283(5407):1476-1479

12      郑学学,朱莉,廖相如,等.细菌中常见的蛋白翻译后修饰.生物通讯技术,2009,204):722-727

13      Juliano RL, Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants[J]. Biochim Biophys Acta, 1976, 455(1):152-162

14      Jekerle V, Klinkhammer W,Scollard DA, et a.l Invitro and in vivo evaluationofWK-X-34, a novel inhibitor of P glycoprotein andBCRP,using radio imaging techniques[J].Int J Cancer,2006,119(2):414-422

15      Engelender MartelliC, et.a l The functions and structure of ABC transporters: implications for the design of new inhibitors of P-gp and MRP1to control multidrug resistance(MDR) [J].Curr Drug Targets,2006, 7(7): 893-909.

 

 

 

 

 

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